1.2方法
1.2.1菌種活化
取-80℃保存的水稻黃單胞菌，使用接種環蘸取菌液在NA平板上劃線，在30℃恒溫培養箱中倒置培養2~3 d，隨后挑取單菌落接種于5 mL NB培養基中，30℃、180 r min-1培養24 h。
1.2.2噬菌體分離與純化
將水樣在5000×g下離心10 min，使用抽濾泵和0.45μm濾膜對上清液進行過濾，在濾液中添加MgSO4至終濃度為50 mmol L-1，靜置10 min后使用0.22μm濾膜抽濾。收集0.22μm濾膜放入100 mL洗脫液(3%吐溫80，3%牛肉膏，5 mmol L-1 NaCl)中，超聲20 min后過濾除菌，所得濾液即為噬菌體原液。
吸取100μL水稻黃單胞菌與100μL上述噬菌體原液加入到5 mL NB培養基中，30℃、180 r min-1培養24 h，過濾除菌后得到擴培液。重復此擴培過程3次。取100μL菌液加入5 mL NB(0.4%瓊脂，2 mmol L-1 CaCl2)培養基中，倒入NA固體平板中，待其凝固后，使用擴培液點樣，置于30℃恒溫培養箱24 h，觀察有無噬菌斑形成。使用雙層板法純化噬菌體，挑選單個噬菌斑到5 mL NB培養基中過夜培養，離心，取上清液過濾，濾液適當稀釋后重復上述操作6~7輪，直至得到大小和形態一致的噬菌斑。得到的噬菌體純化液可置于4℃備用，并加入終濃度為30%的甘油于-80℃保藏。
1.2.3形態觀察
采用CsCl密度梯度離心法純化噬菌體濃縮液，依次將2.5 mL 1.3 g mL-1、2.5 mL 1.5 g mL-1、2.5 mL 1.7 g mL-1濃度的CsCl及噬菌體濃縮液加入到10 mL貝克曼離心管中。使用SW 41 Ti轉子(Optima XPN-100 ultracentrifuge，Beckman Coulter，美國)，200，600×g、4℃離心3 h，在1.3 g mL-1和1.5 g mL-1 CsCl之間形成藍白色條帶，用注射器收集此處的噬菌體顆粒，經磷鎢酸(2%)染色法染色后使用透射電鏡(TEM，Hitachi H-7650)觀察噬菌體形態。
1.2.4噬菌體效價的測定
使用SM buffer對噬菌體擴培液進行10倍倍比梯度稀釋，分別取最后的3個稀釋梯度各100μL噬菌體與100μL宿主菌混勻后加入到5 mL培養基(0.4%瓊脂，2 mmol L-1 CaCl2)中，混勻后傾倒在固體平板上，待瓊脂凝固后轉移至培養箱倒置培養一段時間后對平板上的噬菌斑進行計數，每個處理重復3次。噬菌體效價(Phage titer，pfu mL-1)=平均噬菌斑個數×噬菌體稀釋倍數×10。
1.2.5宿主譜測定
通過雙層平板點樣法鑒定宿主譜。將噬菌體效價分別稀釋為1×1010~1×106 pfu mL-1 5個梯度。將100μL菌液加入到含0.4%瓊脂的5 mL NB培養基中，混勻倒于NA平板上，吸取5個梯度的2μL噬菌體培養液分別滴至平板，將平板倒置于30℃恒溫培養箱中培養24 h后觀察有無噬菌斑出現。
1.2.6噬菌體測序及基因組分析
使用苯酚—氯仿法提取噬菌體DNA。通過Illumina Miseq測序平臺對提取的噬菌體DNA進行測序，通過SPAdes v.3.12.2拼接組裝，獲得噬菌體的全基因組序列。將噬菌體的全基因組序列在NCBI數據庫中的BLASTn進行比對，使用ANIm進行核苷酸序列相似性計算。通過Prokka對噬菌體基因組信息進行注釋。利用在線網站對基因組進行可視化分析。分別利用耐藥性基因數據庫、毒力因子數據庫、tRNA Scan-SE在線網站分析噬菌體是否含有耐藥基因、毒力基因及tRNA基因。
1.2.7蛋白網絡圖分析和系統發育樹構建
為進一步確定噬菌體的親緣關系，對其進行蛋白網絡圖分析和系統發育樹構建。采用vConTACT 2.0、Cytoscape 3.7.2繪制噬菌體蛋白網絡圖。系統發育樹選取保守性較強的末端酶大亞基蛋白(TerL)基因作為標志基因，用FastTree構建系統發育樹。
1.2.8最佳感染復數測定
噬菌體感染復數(multiplicity of infection，MOI)是指噬菌體與宿主菌數量的比值。參考前人的文獻并進行了一些修改，將噬菌體稀釋成1×1010~1×104 pfu mL-1，將宿主菌用SM buffer調整至1×108 cfu mL-1。根據不同MOI(100、10、1、0.1、0.01、0.001、0.0001)分別取100μL對應效價的噬菌體液和100μL宿主菌加入5 mL NB(2 mmol L-1 CaCl2)中，30℃、180 r min-1共培養24 h，離心去除細菌沉淀，取上清使用雙層平板法測定效價。試驗重復3次，測得效價最高的MOI為最佳MOI。
1.2.9一步生長曲線測定
一步生長曲線反映了噬菌體復制過程中數量的動態變化，是衡量噬菌體裂解能力的一個重要指標。按照MOI=0.1分別取100μL 1×107 pfu mL-1噬菌體和100μL 1×108 cfu mL-1宿主菌與800μL SM Buffer(含2 mmol L-1 CaCl2)混勻，30℃靜置30 min后8000×g離心2 min，使用0.45μm濾頭過濾，取上清液計算未吸附的噬菌體數量。同時用1 mL SM Buffer重懸沉淀，取100μL重懸液加入9.9 mL NB(含2 mmol L-1 CaCl2)培養基中混勻，取適量混合液過濾，記為1 h，測定噬菌體效價。將剩余混合液在30℃、180 r min-1條件下培養，每隔1 h取一次樣，直至12 h。將濾液進行適當稀釋，通過雙層平板法測定不同時間點的噬菌體效價。噬菌體爆發量(pfu cell-1)=噬菌體爆發量平穩期平均爆發量/吸附進入宿主菌的噬菌體數。
1.2.10噬菌體耐受性測定
研究噬菌體的耐受性主要是測定噬菌體對溫度、pH和紫外線的耐受性。溫度耐受性試驗參考Zhang等的方法，把噬菌體效價調整為1×108 pfu mL-1，取1 mL噬菌體液放置于不同的溫度(4、20、30、37、40、50、60、70、80℃)下水浴1 h，測定噬菌體的效價。噬菌體pH耐受性試驗參考Kumar等的研究，利用1 mol L-1的氫氧化鈉和鹽酸將NB液體培養基調成不同的pH(2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12)。將100μL噬菌體(1×109 pfu mL-1)分別加入到900μL不同pH的NB溶液中，37℃溫浴1 h，測定噬菌體的效價。對于紫外耐受的測定，根據前人做一定修改，將10 mL噬菌體(1×108 pfu mL-1)加入無菌培養皿中。并在生物安全柜內將培養皿放于紫外燈(254 nm，25 W)下方15 cm，照射30 min，每隔5 min取一次樣，最后測定所有樣品效價。以上試驗全部重復3次。
1.2.11噬菌體抑制黃單胞菌試驗
通過監測細菌OD600的變化，評估噬菌體對黃單胞宿主菌Xoo 2068的抑制作用。將噬菌體效價稀釋為1×1010~1×104 pfu mL-1，將宿主菌稀釋為1×108 cfu mL-1。根據不同MOI(100、10、1、0.1、0.01、0.001、0.0001)分別取100μL噬菌體和宿主菌加入96孔板中混合均勻，對照組用SM buffer代替噬菌體。將96孔板放入預熱好的30°C酶標儀中，測定OD600的值，記為0 min。每6 h測量一次，持續48 h，試驗重復3次。
1.2.12數據分析
采用單因素方差分析(ANOVA)和Tukey事后檢驗進行數據分析，P<0.05表示有顯著性差異。利用軟件GraphPad Prism 8.0繪圖。
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