1.3.7 SCB2505代謝物對液化沙雷氏菌細胞壁完整性的影響
取1.3.2節所得菌懸液500μL至2 mL離心管中,再取質量濃度分別為1.0 MIC、2.0 MIC和4.0 MIC代謝物溶液500μL加到離心管中,使代謝物終質量濃度分別為0.5 MIC、1.0 MIC、2.0 MIC,以無菌去離子水替代代謝物作為對照,每個濃度3個管,于28℃培養4 h。5 000 r/min,4℃離心10 min,取上清液。參考AKP試劑盒步驟進行操作,測定上清液中AKP活力。
1.3.8 SCB2505代謝物對液化沙雷氏菌細胞膜完整性的影響
參照蘇曉丹[18]的PI染色法并稍作修改。取1.3.2節所得菌懸液500μL至2 mL離心管中,再取濃度分別為1.0 MIC、2.0 MIC和4.0 MIC代謝物溶液500μL加到上述離心管中,使代謝物終質量濃度分別為0.5 MIC、1.0 MIC、2.0 MIC,以無菌去離子水替代代謝物作為對照,每個濃度3個管,于28℃培養4 h。將培養好的菌液以5 000 r/min,4℃離心10 min,棄上清液,所得菌體用PBS重懸洗滌2次后,離心棄上清液,PBS重懸,加入PI染料(終質量濃度為10μg/mL),4℃避光孵育30 min,PBS重懸洗滌2次,離心棄上清液,PBS重懸,取菌懸液10μL在熒光顯微鏡下觀察。激發波長為535 nm,發射波長為615 nm。
1.3.9 SCB2505代謝物對液化沙雷氏菌細胞形態的影響
取1.3.2節所得菌懸液20 mL于50 mL離心管中,再取濃度分別為1.0 MIC、2.0 MIC和4.0 MIC代謝物溶液20 mL加到上述管中,使代謝物終質量濃度分別為0.5 MIC、1.0 MIC、2.0 MIC,以無菌去離子水替代代謝物作為對照,于28℃培養10 h。將培養好的菌液4 000 r/min離心10 min,棄上清液,所得到的菌體用PBS重懸洗滌2次后,將菌體懸浮于2.5%戊二醛-PBS溶液固定(4℃)。過夜后用PBS洗滌菌體3次,后置于1%鋨酸中固定30 min,隨后用不同濃度的乙醇梯度洗脫。最后將樣品滴加至專用玻片并貼附于場發射掃描電鏡載物臺,用臨界點干燥儀干燥8 h后鍍金,使用場發射掃描電子顯微鏡(field-emission scanning electron microscope,FESEM)觀測細菌細胞形態。
1.3.10數據統計分析
采用Origin 2022軟件(OriginLab Corporation,USA)進行繪圖,SPSS Statistics 26.0(IBM Corp.,USA)對數據進行ANOVA分析或t檢驗,實驗重復3次,取測定結果的平均值,數據用平均值±標準誤差表示。
2結果與分析
2.1 SCB2505代謝物MIC的測定
由表1可知,對于液化沙雷氏菌SCB2649菌株,植物乳桿菌SCB2505代謝物質量濃度為4 mg/mL時,液體培養基渾濁,指示菌液化沙雷氏菌SCB2649菌株有明顯的生長現象發生,但質量濃度為8 mg/mL的試管中液體清澈,指示菌SCB2649菌株無明顯的生長現象,因此植物乳桿菌SCB2505代謝物對該指示菌的MIC可確定為8 mg/mL。
表1 SCB2505代謝物對液化沙雷氏菌最小抑菌濃度
注:“+”代表渾濁;“-”代表澄清。
2.2 SCB2505代謝物對液化沙雷氏菌生長曲線的影響
由圖1可知,對照組的液化沙雷氏菌SCB2649菌株在24 h內快速增長,在24 h時OD600nm值為0.912。加入植物乳桿菌SCB2505代謝物濃度為0.5 MIC時,液化沙雷氏菌SCB2649菌株生長受到明顯的抑制作用,相同時間的OD值明顯低于對照組。加入代謝物濃度達到1.0 MIC時,液化沙雷氏菌SCB2649菌株生長完全被抑制,24 h內其OD600nm值沒有變化。說明植物乳桿菌SCB2505代謝物濃度達到1.0 MIC時,在液體培養時也能夠有效抑制液化沙雷氏菌SCB2649菌株生長繁殖。
圖1 SCB2505代謝物對液化沙雷氏菌SCB2649菌株生長的影響
2.3 SCB2505代謝物抑菌成分分析
2.3.1熱穩定性
如表2所示,經70℃處理20 min后,SCB2505代謝物對液化沙雷氏菌SCB2649菌株的抑菌效果與對照組相比無顯著差異(P>0.05),而100℃和121℃處理后的代謝物抑菌效果顯著下降(P<0.05),但相對抑菌活性仍有90%左右保留。說明植物乳桿菌SCB2505代謝物中抑菌活性物質具有較好的耐熱性,但可能其中有部分抑菌物質對熱較為敏感。
表2高溫處理對SCB2505代謝物抑菌活性的影響
注:采用t檢驗分析實驗組及對照組抑菌圈直徑的顯著性差異(P<0.05),以*表示。