摘要:自然界中微生物種類繁多、功能多樣、分布廣泛，對人類健康安全、生態穩定和物種進化等發揮不可替代的作用。盡管微生物培養技術至今已有一百多年，然而由于各種限制因素的制約，目前成功分離培養的微生物僅占0.1%?1.0%，自然界中仍有十分豐富的微生物資源有待挖掘和開發利用。如何理解難培養微生物的制約因素并探索作用機制，同時借此開發新型微生物培養方法則尤為必要。本文首先分析了典型環境微生物生長的限制因素，然后介紹了目前利用傳統培養改進措施進行分離篩選的研究成果，進一步綜述了原位培養、共培養、微流控培養技術、細胞分選技術等新型培養技術在難培養微生物分離培養中的應用，最后對目前培養法存在的瓶頸問題進行深入分析，提出今后可在多技術聯合使用、難培養微生物復蘇機制、微生物互作機制、代謝途徑與調控機制等方面進行研究，以期為今后微生物資源開發利用提供借鑒。
地球生物圈中微生物種類繁多、功能多樣，它們扮演著生產者、消費者和分解者的角色，廣泛參與碳、氮、硫等各種生物地化循環。據推算，大約有1011-1012種微生物存在于地球的各個生物圈中[1]。利用傳統培養法分離微生物至今150多年，成千上萬種微生物得以分離，但截至目前可培養微生物僅占總微生物的0.1%-1.0%[2]。絕大部分微生物無法培養，這些微生物常常被稱為“暗物質”。盡管隨著基于聚合酶鏈式反應(Polymerase Chain Reaction，PCR)，如克隆文庫、變性梯度凝膠電泳(Denatured Gradient Gel Electrophoresis，DGGE)、熒光原位雜交技術(Fluorescence in situ Hybridization，FISH)、實時熒光定量PCR(Real-Time Quantitative PCR，qPCR)、限制性片段長度多態性(Restriction Fragment Length Polymorphism，RFLP)和高通量測序等分子生物技術的蓬勃發展，越來越多的微生物通過免培養技術被發現，功能基因被陸續挖掘并利用。然而這些分子生物技術并不能替代培養法。其原因在于，即使通過(宏)組學技術發現了代謝途徑獨特新穎、功能強大的微生物，如果不能分離篩選這些微生物，其生理特點、代謝機制及生態功能就無法研究驗證，應用也就無從談起[3]。因此，測序法和培養法應互為補充，缺一不可。近年來，絕跡稀釋法(Dilution-to-Extinction)、原位培養、共培養(Co-Culture)、流式細胞分選技術及微流控培養技術等新型培養方法陸續出現，為高效地分離篩選更多微生物帶來了曙光。
本文首先分析了環境微生物生長的典型限制因素。然后，對傳統培養法的改進措施、新型培養手段(原位培養、高通量培養法、微流控培養技術等)的原理、特點及優缺點進行介紹，分析并總結現今培養法的研究成果。最后，對目前培養法的瓶頸問題進行分析并提出解決措施，以期為今后利用培養法分離篩選更多微生物，特別是難培養的功能微生物的培養提供參考。
1未培養環境微生物生長的限制因素
自然界中生長的微生物在現有培養條件下不能生長，原因可能有7種。
1.1大多數未培養微生物處于活的非可培養狀態
自然環境中有99%以上的微生物處于活的非可培養(Viable but Non-Culturable，VBNC)狀態[4]。另外，人工實驗條件會引起生長環境的改變，使原本能通過常規方法正常分離培養的環境微生物因無法適應而進入VBNC狀態。這些VBNC微生物大多處于休眠狀態，僅維持著最低代謝活性。然而，目前在實驗室通過常規手段根本無法使其復蘇并分離培養[4]。
1.2微生物的豐度和競爭能力低
在自然界復雜的微生物群落中，存在許多豐度低但代謝功能強的微生物[5]。鑒于目前研究人員仍無法確定這些低豐度微生物中相對豐度最高的微生物所生長的自然環境，導致無法進行有效富集；另外，即使某些微生物豐度相對較高，但如果培養基中底物豐富或以發酵底物作為碳源，在分離培養時，生長更快的微生物有可能迅速戰勝生長緩慢的目標微生物，所以競爭力低仍可能導致培養失敗[5]。
1.3無法模擬微生物生長的真實自然環境
由于對目的微生物所棲息的自然環境缺乏深入理解，例如，對微生物生長代謝過程中起關鍵作用的營養因子、不同生理階段對基質濃度的需求、生長所需環境條件的變化規律等知識嚴重認識不足，導致在實驗室條件下無法提供目的微生物生長所需的真實營養需求及培養條件。某種關鍵營養因子或生長條件不能滿足往往會導致微生物的培養失敗[6]。
1.4生長速率較低，檢測手段不夠靈敏
一些寡營養或生長緩慢的微生物細胞組成的超微型菌落，如果培養時間不夠或者檢測技術靈敏性不高，那么這些微生物的生長就不易被發覺，往往被忽略，表現為“未培養”[7]。
1.5培養基富營養化
由于自然界中數量龐大的環境微生物可利用的營養物質比較匱乏，多數處于“寡營養”狀態[8]。高濃度營養物質比較適合生長快且對其有抵抗能力的微生物，但可能會抑制那些生長速度較慢的微生物[9]，寡營養培養基可用于培養生長緩慢的細菌[10]。當微生物處于寡營養水生環境時，如果轉移到富營養培養基中，會因不適應而突然死亡[10]。
1.6破壞或者忽視了環境中微生物之間的相互作用
自然界中的所有微生物并不是孤立存在，而是相互聯系和影響的。許多微生物之間可進行物質交換和信號交流，它們聯系緊密甚至高度依存。然而在實驗室采用傳統培養法分離篩選目的微生物時會人為破壞這種依存關系，導致分離培養的失敗[11]；另外，當前對環境微生物之間的這種高度復雜的互作機制研究并不多，認識不夠深入、全面，導致不能指導難培養微生物的分離。
1.7病毒感染導致的培養效率降低
某些海洋環境樣品中，7%的菌群攜帶病毒，表層海水死亡細菌中大概10%-50%是由病毒感染引起的[12]。
2環境中未培養微生物培養方法的開發與應用2.1常規培養方法的改進
環境微生物的生長除了需要適宜的生長條件和常規的碳源、氮源等營養物外，可能更需要信號分子、關鍵酶或蛋白及電子供體/受體等某些關鍵營養物質，這些關鍵物質或有利于關鍵生化反應生物酶的合成而維持微生物必需的生命代謝活動，或可促進處于VBNC狀態的微生物復蘇以恢復其活性。
2.1.1培養基的優化與調整
(1)添加抑制劑、樣品抽提液或菌液
添加某種抑制劑(如抗生素)以抑制非目的菌的生長。本課題組以醬香型大曲為研究對象，對培養基進行改進，添加抑制劑結合熱處理，分離出一株耐熱性良好的放線菌FBKL4.010[13]。樣品浸提液含有豐富的營養物質，向培養基添加浸提液是傳統培養的重要手段。Nguyen等利用土壤提取液(80%甲醇浸提)制備的強化培養基對根際土壤進行分離，成功培養了許多以前未培養的細菌菌株，化學分析結果表明，土壤浸提液中含有低分子量有機物組分供微生物生長[14]。另外，Xian等利用Tepidimonas SYSU G00190W上清液的改良培養基，用于西藏和云南溫泉樣品中Chloroflexi的定向分離，從這些培養基中分離出的大多數菌落為未培養的Chloroflexi，其中36個為潛在新物種；代謝組學研究表明，培養上清液含有多種低分子量的有機基質，可作為這些細菌生長的潛在營養物質[15]。
(2)添加信號分子、電子供受體等物質
在自然環境復雜的微生物群落中，微生物之間緊密聯系、相互作用，它們之間通過信號分子進行信息交流。研究表明，信號分子環磷酸腺苷(Cyclic Adenosine Monophosphate，cAMP)和酰基高絲氨酸內酯(Acyl-Homoserine Lactones，AHL)可顯著提高海洋細菌的培養效率[16]。Bruns等向培養基中加入AHL、cAMP等信號分子對富營養化湖泊天然浮游細菌進行培養，發現這種方法能促使細菌得到培養。其中，cAMP是最有效的信號分子，10μmol/L cAMP可使約占總數10%的微生物細胞培養出來，但培養出來的細菌如果不繼續添加信號分子，則又停止生長[17]。高絲氨酸內酯(Homoserine Lactones，HSL)作為群體感應信號分子可改善微生物的培養狀況[18]。Guan等向含低濃度鐵的培養基中加入外源的鐵載體和C8-HSL，發現原本在低濃度鐵培養基上不能生長的海洋細菌也能形成菌落[19]。此外，根據微生物的特性，添加生長所需的電子供受體也可提高微生物可培養率[11]。Sorokin等以甲酸鹽或氫作為電子供體，以單質硫、硫代硫酸鹽或二甲基亞砜作為電子受體，對高鹽環境的沉積物樣品進行分離培養，最終分離到Halodesulfurarchaeum新屬的8株菌[20]。
(3)添加維生素、生物酶或蛋白因子
Harbison等通過向培養基中添加維生素，從酸性沼澤中分離出一種專性厭氧、嗜酸的α-變形菌門(Alphaproteobacterium)新菌株，命名為CS4T[21]。另外，有研究者通過添加生物酶來提高微生物可培養率。Kim等通過向培養基中添加H2O2酶，成功分離培養了2株淡水放線菌acI譜系的新菌株，即Prochlorococcus和Pelagibacter[22]；同時，添加超氧化物歧化酶(Superoxide Dismutase，SOD)和H2O2酶等可降低培養過程中優勢菌種代謝所產生的自由基、過氧化物和一些拮抗物質的毒害作用，使微生物的培養效率提高[23]。對于VBNC微生物，添加藤黃微球菌分泌的復蘇促進因子(Resuscitation-Promoting Factor，Rpf)有助于促進其復蘇和生長[24]。余曉云利用藤黃微球菌Rpf從新疆土壤極端環境中分離篩選VBNC狀態菌，共分離得到60株菌，其中VBNC菌48株，14株為潛在新種[25]。翟竟余也對制藥廢水樣品進行VBNC菌的分離篩選，共獲得了23株VBNC菌，包括Pseudomonas屬內的新種細菌Pseudomonas pharmacopolae sp.nov.[26]。
(4)其他凝固劑代替瓊脂或改進瓊脂培養基制備方法
瓊脂作為常規培養基的凝固劑，對某些微生物具有一定程度的毒害作用，從而降低了可培養率；而使用結冷膠作為凝固劑不僅對微生物沒有毒害作用，還可能增強受瓊脂抑制微生物的生長，凝固效果比瓊脂更好[27]。2005年，Tamaki等研究發現結冷膠培養基上的菌落數比瓊脂培養基上的多10倍，約60%為新種[28]。2009年，該團隊又比較了瓊脂和結冷膠對從淡水沉積物中微生物菌落形成的影響，結果發現，108株菌中有22株只能在結冷膠培養基上形成可見菌落，并表現出新種的潛質，剩下的86株在瓊脂和結冷膠上都生長，但其中52株在結冷膠上生長得更快；此外，結冷膠還顯著地促進了具有代表性的生長緩慢微生物Gemmatimonas aurantiaca的菌落形成[29]。
除了用結冷膠代替瓊脂之外，有研究者還通過改進瓊脂培養基的制備方法來提高微生物的可培養性。2014年，Tanaka等使用Gemmatimonas aurantiaca T-27T和3種代表性的環境樣品(土壤、沉積物和水)作為接種物，綜合比較了PT培養基(將磷酸鹽和瓊脂同時滅菌)和PS培養基(將磷酸鹽和瓊脂分別滅菌)上的菌落數目情況，結果表明，PS培養基上的菌落數更多，對PT培養基進行化學分析表明H2O2抑制了微生物生長[30]。2018年，Kato等也利用PT培養基和PS培養基同時分離篩選森林土壤或池塘底泥的微生物，結果發現，在PS培養基上的菌落數目明顯多于PT培養基，經過7 d以上的培養分別從PS培養基和PT培養基中分離出了98株和74株菌落作為慢速生長菌，通過PS培養基篩選到了一株α-變形菌門的新菌株[31]。另外，其他研究者通過PS培養基分離篩選到難以培養的烷烴降解菌[32]和放線菌[33]。
對培養基進行優化與調整的方法經濟實用、針對性較強、操作較簡單，但對于一些需要其他菌株輔助才能生長的類群分離效果就較差。同時，由于人們對某些微生物的認識不全面，因此難以根據微生物的特性來設計合適的培養基。
2.1.2培養條件的優化
(1)延長培養時間
延長培養時間可大幅度提高未培養微生物的培養率，有利于生長緩慢的微生物生長，但應注意控制培養時間，因為培養時間越長，對微生物培養環境的無菌要求就越高[34]，而且培養基的營養成分會隨時間推移發生改變，可能會對微生物的生長產生不利的影響。Choi等通過采用寡營養培養基和延長培養時間從海洋沉積物中分離微生物，分離出2株新海洋細菌，即Mooreiaceae和Catalimonadaceae[35]。Sun等在處理高濃度有機廢水的中溫升流式厭氧污泥床反應器中，采用富集培養基并延長培養時間對微生物進行培養，培養14 d后，成功地從污泥中分離出一株新厭氧菌TC1T，將其命名為Flexilinea flocculi gen.nov.sp.nov.[36]。Pulschen等通過采用寡營養培養基、延長培養時間及選擇生長緩慢的細菌，從南極土壤樣本中分離微生物，成功地分離出了一些稀有的微生物，如Lapillicoccus、Flavitalea、Quadrisphaera、Motilibacter和Polymorphobacter[37]。賀瑞含從南北極環境中采集不同類型的樣品，通過改進培養溫度、延長培養時間，采用稀釋R2A培養基分離出細菌約1 220株，其中包括182個潛在新物種[38]。
(2)絕跡稀釋法
絕跡稀釋法(Dilution-to-Extinction)是通過將環境樣品中微生物群體總數稀釋至痕量后再進行培養的方法[39]，該方法降低了優勢微生物的占比，可提高寡營養微生物的可培養率[40]。Stingl等采用改進的絕跡稀釋法從俄勒岡海岸和百慕大海域中培養微生物，分離出17株SAR11新菌株，以及幾株以前未培養的細菌種類[41]。Colin等采用絕跡稀釋法將河口沉積物稀釋至痕量后，采用384微孔細胞培養板分離硫還原菌，篩選到很多硫還原菌新種[39]。Jimenez-Infante等采用絕跡稀釋法將紅海表層水樣接種于改良的低營養培養基，培養4周，結果得到2株SAR11新菌株，分別命名為RS39和RS40[42]。Bartelme等采用絕跡稀釋法將從針葉林淺表層土壤中提取的微生物細胞稀釋后，分別接種于2種培養基(這2種培養基的氨基酸和有機碳濃度相差100倍)，于96孔板、16℃下進行培養，共分離出133株菌，其中包括以前未培養的菌株，這些菌株與Nakamurella、Nocardioides、Mycobacterium、Jatrophihabitans、Patulibacter、Conexibacter、Rhizobiales sp.、Reyranella和Microtrichales sp.strain AZCC_0197的序列最大相似性小于97%[43]。Henson等采用絕跡稀釋法培養浮游細菌，成功分離了8個新屬和7個新種的菌株[40]。
絕跡稀釋法一般采用96孔或者384孔板進行高通量并行操作，提高了分離效率，但操作較復雜，周期較長。同時，由于每個孔的頂部空間是完全隔離的，因此很難供應氣態底物；此外，當以小體積培養細胞時，由于孔內液體蒸發會導致培養物變干，從而不利于微生物生長[5]。
2.2共培養
自然生境中微生物之間的相互作用對群體生存來說非常重要[44]。這些相互作用通常是通過環境改變來介導的，微生物通過占用資源和排泄代謝產物來改變環境，從而影響自身和其他微生物的生長[45]。大多數共生菌對體外培養有抗性[46]，對相鄰細菌產生的信號和化學因子的生長依賴性可能是阻礙細菌離體生長最重要的因素[6]。營養缺陷型細菌的基因組較小，缺乏必要的遺傳物質來編碼必需的營養素，通常需要與其他細菌建立緊密的共生關系才能生存[6]。
自然生境中許多細菌依靠共生關系維系生長，有研究者通過添加細菌進行共培養來提高培養率，如：Nichols等通過添加輔助菌株分離出一種新的嗜冷桿菌屬[47]；海洋沉積物中的自養氨氧化古生菌在與硫氧化細菌共培養時被成功地富集和培養[48]；D’Onofrio等發現在海洋沉積物中廣泛存在鐵載體依賴的未培養細菌，來自鄰近物種的鐵載體可以誘導其生長[49]；共生異養菌(如交替單胞菌Alteromonas等)可通過清除H2O2促進原綠球藻屬(Prochlorococcus)的生長[50]。此外，交互共生培養法(Cross-Feeding Cultivation)也可提高培養率，如Kaeberlein等研究發現雖然菌株MSC1和MSC2很容易在培養皿中維持生長，但只能在共培養中實現，同樣，MSC1可以在培養皿中與另外2株菌(MSC4和MSC5)中的任意一株進行共培養[51]；Bhuiyan等報道了由菌株GF9(Sphingopyxis)產生的卟啉型生長因子A-F在皮摩爾到納摩爾濃度下，可誘導先前未培養的菌株ASN212(Leucobacter)顯著增殖，但卻對產生菌GF9自身產生了毒性，GF9菌株與ASN212菌株的共培養試驗表明，ASN212菌株有助于GF9菌株長期培養[52]；吳家法對共培養30 d后的微包埋微生物采用流式細胞儀分選，分選后分別用MR2A和共培養流出液進行培養，結果獲得了100株細菌，其中8株疑似新種[53]。
共培養作為一種新型培養法，考慮了真實自然環境下微生物互作對微生物生長的影響，對于互生或共生關系的微生物針對性較強。但由于當前對微生物間的互作機制及其對生長特性的影響研究有限，所以成功篩選出的難培養微生物種類并不多，需要進一步加大微生物互作與生長之間關系的研究。
2.3原位培養
原位培養是將稀釋的環境樣品置于區室獨立小孔中，用半透性膜(0.03μm/0.2μm)上下封閉小孔，最終將其放回原來所棲息的自然環境或模擬生境中進行培養。裝置的孔之間互不干擾，由于半透膜的選擇性，孔內外的微生物細胞無法進出半透膜，但自然環境中的某些信號分子或關鍵營養因子等小分子能穿透半透膜進入孔中，為微生物所利用，進而促進孔中難培養微生物的生長。原位培養法主要包括擴散室法、分離芯片法、Trap技術、I-tip技術和膠囊包埋技術。這些方法都是通過模擬目標微生物的自然環境進行分離培養，有利于微生物與微生物或與自然環境之間建立化學交流。有關原位培養方法的開發與應用如表1所示。
表1原位培養的應用
2.3.1擴散室
2002年，Kaeberlein團隊設計了一種名叫“擴散室”(Diffusion Chamber)的裝置(圖1)，可用于培養海洋潮汐帶沉積物中的微生物，裝置由金屬環(墊圈)和緊貼兩側的半透性薄膜(孔徑為0.03μm)構成[51]。將樣品瓊脂混合物注入裝置密封后進行原位培養，培養過程中，營養物質會通過下層薄膜擴散到中間墊圈滿足微生物生長，裝置中的微生物也可與自然環境建立化學交流；但因薄膜孔徑很小，所以裝置內外的微生物不能相互擴散[51]。利用擴散室能提供環境微生物生長所需的營養，而不必弄清其確切成分，方便便捷；但仍存在一定的局限性，比如通過擴散室培養的環境細胞形成的菌落一般很小，肉眼不可見[63]，較難檢測和分離，也就很難進行高通量培養分離[73]；樣品的稀釋水平會影響擴散室培養微生物的效果；對平板制作和膜材料選擇要求也較高，不能破壞微生物生長[11]。
圖1擴散室裝置[51]Figure 1 Diffusion chamber for in situ microbial cultivation[51]
在此基礎上，不同類型膜基系統已被開發并應用到自然環境樣品的分離培養中，很多緩慢生長的菌落也可被成功培養[44]。
2.3.2分離芯片
在開發應用擴散室法培養微生物的基礎上，Nichols等開發了一種名叫“分離芯片”(Isolation Chip，ichip)的高通量分離裝置(圖2)，可用于大量分離培養環境中的未培養微生物[62]。使用時，將有上百個通孔的分離板放在已稀釋的含樣品微生物細胞的培養基懸液中(圖2A)，使每個通孔捕捉到含有適量微生物細胞的培養基(圖2B)，最后將分離板夾在聚碳酸酯膜(孔徑為0.03μm)與上下兩層板構成的半透性屏障中間(圖2C)，將裝置置于目標微生物所棲息的環境中進行原位培養[62,74]。
圖2分離芯片[62]Figure 2 Isolation chip(ichip)[62]
通過實驗證明，這種方法分離得到的微生物數量遠遠超過了傳統分離方法，而且更有可能分離到新物種[73,75]。其原因可能是ichip中的細胞與外界環境的距離較近，信息交流更方便，會促進細胞生長；采用ichip法可進行高通量的分離培養；用顯微鏡觀察每個小孔中生長的微生物，避免了菌落觀察不到而被忽略的問題[11]。
2017年，Berdy等分別比較了ichip法和平板法分離培養海洋底泥和土壤中的微生物，發現無論是菌落數、菌落形態以及新種數目，ichip法均遠遠優于傳統平板法；作者也總結了ichip法的不足：(1)某些微生物的生長不僅依賴于在自然界中特定生長因子和/或鄰近物種的代謝產物，而且還需要共生微生物的物理接觸；(2)該方法不能用于培養干旱環境的微生物；(3)將ichip放置在水生沉積物表面，但沉積物表面常常出現含氧層，會導致ichip下形成缺氧環境，使ichip孔內的細胞接觸的是非自然的環境[76]。以上這些限制都會影響樣品微生物的分離培養。
2.3.3 Trap技術
鑒于擴散室不能對放線菌進行選擇性的分離，Gavrish等報道了一種用于分離絲狀放線菌的Trap裝置(圖3)，該裝置的結構與“擴散室”相似，只是底部的半透膜孔徑為0.2-0.6μm，孔徑加大是為了能讓菌絲體穿過半透膜進入生長盒，使用時將Trap裝置(墊圈內最初為無菌固體培養基)置于盛有潮濕土壤樣品的培養皿中，裝置底部與土壤接觸良好，絲狀微生物選擇性地滲入裝置并形成菌落，黑暗條件下培養14-21 d[65]。
圖3 Trap裝置及示意圖[65]Figure 3 Image and diagram of the trap[65]注：1：底膜(孔徑0.2-0.6μm)；2：頂膜(孔徑0.03μm)；3：無菌瓊脂或結冷膠培養基；4：塑料或金屬墊圈Note:1:Bottom membrane filter(0.2-0.6μm pore size)；2:Top membrane filter(0.03μm pore size)；3:Agar or gellan gum；4:Plastic or metal washer
2012年，Jung等開發了一種新Trap式的濾板微捕集器(Filter Plate Micro Trap，FPMT)；FPMT是一種從自然環境中分離細菌的原位培養裝置，以過濾微孔板為主體(圖4A)，長12.4 cm、寬8.1 cm、高3 cm，由96個獨立的圓柱形空間作為培養微生物的腔室(圖4B)；培養時將裝置放在土壤樣品上，以誘集微生物進入腔室，微生物生長所需的某些營養物質也可擴散到培養基中[66]。
圖4 UNIFILTER過濾微孔板照片(A)和FPMT一孔示意圖(B)[66]Figure 4 Photograph of the UNIFILTER filtration microplate(A)and schematic diagram of one well of FPMT(B)[66]注：1：蓋子；2：培養基；3：PVDF濾膜(孔徑0.45μm)；4：土壤或者底泥樣品；5：微生物Note:1:Cover；2:Medium；3:0.45μm pore size PVDF filter；4:Soil or silt sample；5:Microorganisms
2.3.4 Isolation-Tip技術
2014年，Jung等開發了一種名叫“Isolation-Tip(I-tip)”的裝置(圖5)，可用于分離海綿共附生微生物。使用時，將裝置插入海綿的不同組織處(深度為0.5 cm)進行培養，4周后將裝置中富集的細菌用平板法再進行分離培養[68]。I-tip法也存在一定的局限性，比如若要將裝置應用在流動的海水中就需進行固定[77]。
圖5 I-tip裝置示意圖[68]Figure 5 Schematic diagram of the I-tip[68]注：1：黃色Tip(20-200μL)；2：微生物在I-tip中培養；3：50-100、150-212μm玻璃微珠；4：防水膠布；5：0.7%瓊脂培養；6：微生物由此進入I-tip Note:1:Yellow tip(20-200μL)；2:Microbes are cultivated in I-tips；3:50-100,150-212μm glass beads；4:Waterproof adhesive；5:Medium with 0.7%agar；6:Microbes can penetrate between beads
2.3.5膠囊包埋技術
膠囊包埋技術又稱為單細胞封裝培養法、凝膠微滴培養法(Gel MicroDroplets，GMDs)。Zengler等設計了一個方法，將稀釋后的環境樣品與瓊脂糖混合，乳化成微滴(即微滴包埋膠囊)，然后將其裝入層析柱內(層析柱用濾膜封口)，包埋膠囊在低營養的流動培養液中進行培養，再結合流式細胞儀分選技術，將包含有單菌落的膠囊分選到含有培養基的96孔板中繼續培養，最終獲得純培養物[69]。這是一個開放連續補充營養的微系統，微生物間的代謝產物及信號分子可在膠囊間進行擴散而被其他菌利用[44]，較好地模擬了微生物的自然生長條件。該方法能高通量地分離培養微生物，而且更易進行下游的擴大培養，提高了微生物的培養率；但該方法成本較高、操作較復雜，而且存在一些技術問題，如包埋基質機械強度低、透性差、微生物熱敏感等，因此還需要不斷改進[78]。
原位培養技術通過模擬目標微生物的自然環境來分離培養微生物，有利于微生物與微生物或微生物與自然環境之間建立化學交流，可在一定程度上提高環境微生物的成活率以及未培養或稀有類群的培養率[79]，但其成本較高、下游的分離純化鑒定工作量很大、周期較長、操作較復雜、可控性差，即將人為模擬自然環境條件下培養的微生物轉移到實驗室條件馴化時，若選用的培養基和培養條件不適宜某些微生物的生長，就會使分離效率降低。
2.4微流控培養技術
微流控培養技術(Microfluidics Cultivation)是在微觀尺寸下對復雜流體進行控制、操作和檢測的技術，其能短時間同時檢測多種未培養微生物的存在，還能獲得目標微生物的純培養物[80]。微流控培養和分析設備是在單細胞水平上研究微生物相互作用的通用工具，與傳統培養方法相比，該技術制造工藝和技術設備復雜、專業性強[81]。
2014年，Najah等采用一種超高通量的液滴微流控技術，在不到20 min的時間內篩選超過100 000個細胞；通過將單個細菌在20μL液滴(含熒光纖維二糖水解酶底物的培養基)中隔室分離，直接從麥茬地篩選未培養細菌；根據纖維二糖水解酶活性對液滴進行分選后，細菌種群的纖維二糖水解酶和內切葡聚糖酶活性分別提高了17倍和7倍，并且與選擇在含有淀粉和羧甲基纖維素作為碳源的培養基上生長時相比，分類學上的差異非常大[82]。2016年，Jiang等建立了一種微流控劃線平板法(Microfluidic Streak Plate，MSP)，從多環芳烴富集的土壤中分離到了許多未培養微生物，包括一株能降解熒蒽(Fluoranthene)的芽生球菌(Blastococcus)新種[83]。2019年，趙瑩彤等設計并制備了一種微流控芯片，其單個元件是由上部帶有凹槽的“U”型結構組成，該芯片能捕獲真菌單細胞，對單細胞可正常培養48 h以上，并且能觀察到酵母出芽、孢子萌發等過程，可用于真菌單細胞的捕獲、培養、定位和實時觀察，具有簡單、方便、直觀的特點[84]。
2.5基于細胞分選的培養技術
細胞分選技術通常用來從復雜的微生物群落中分離單個細胞并進行培養。目前細胞分選技術包括光學鑷子和熒光激活細胞分選(Fluorescence Activated Cell Sorting，FACS)等，常與微液滴或微流控技術相結合。Irie等報道了一種利用細胞分選系統對活性污泥微生物群落中未培養的嗜酸菌和硝化螺菌進行物理富集的新方法[85]。Abe等報道了一種基于散射特征的高通量分離技術，將氨氧化細菌菌落直接從活性污泥中分離出來，避免了長時間培養和富集偏差，接種到含培養基的96孔板中進行培養，成功地分離出了亞硝化單胞菌屬(Nitrosomonas)中的新菌株[86]。Fujitani等利用前向散射(Forward Scatter，FSC)和側向散射(Side Scattering，SSC)結合的方式從富集樣品中分離得到了3株硝化螺菌屬中未培養的菌種[87]，并報道了一種針對硝化細菌微菌落形成的分離方法[88]。與傳統的細胞分選機制不同，此技術既能保證培養條件，又規避了種間競爭的影響，但該方法建立的時間較短、技術還不夠成熟，還需繼續探索[80]。
3總結與展望
隨著以原位培養、微流控培養技術和細胞分選技術等為代表的新型培養技術的進一步成熟以及高通量測序的迅猛發展，越來越多的微生物被發現，特別是一些難培養微生物或微生物新種被成功地分離培養，但截至目前絕大部分微生物還是無法培養出來。究其原因，制約大部分微生物無法培養的原因有2個方面：(1)設備昂貴、操作復雜及技術要求高等因素導致原位培養、微流控培養技術、細胞分選技術等新型培養方法還無法廣泛應用；(2)對環境微生物生長所必需的關鍵營養因子或信號分子的種類、VBNC微生物的復蘇過程及機制、微生物互作機制、代謝途徑及調控機制等的認識十分匱乏。
針對目前的研究狀況，我們認為可從以下研究方向著手：(1)針對成功分離到的難培養微生物，從生理特點、代謝途徑及營養需求等方面探索微生物可培養機理，破解其可培養的密碼，為后續其他難培養微生物奠定理論基礎；(2)傳統培養法+新型培養法、培養法+多組學技術等方法的結合，取長補短。比如，將原位培養與共培養或者膜技術結合，既可以模擬自然生長環境，又考慮了微生物與微生物之間的相互作用。目前，培養組學[89]主要應用于培養和鑒定人類腸道微生物，未來可將該技術應用于環境微生物的分離培養；其次，多組學技術能夠深入挖掘功能基因及微生物、揭示重要代謝途徑，發現關鍵蛋白(酶)或代謝物，從分子層面探究微生物代謝途徑和生理生化機制，以期尋找對難培養微生物生長起關鍵作用的營養物質以及培養條件。(3)研究群體感應(Quorum Sensing，QS)與復蘇促進因子之間的關系，從微生物互作的角度揭示VBNC復蘇機制。
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