組蛋白去乙酰化酶抑制劑（HDI）是一類特異性抑制組蛋白去乙酰化酶、促進染色質解螺旋、增強其趨近性，從而調節基因轉錄的小分子化合物。體內、外研究證明組蛋白去乙酰化酶抑制劑可通過抑制腫瘤細胞增殖、誘導凋亡、抑制腫瘤血管生成及轉移、降低腫瘤侵襲力等機制發揮抗腫瘤作用，與放射聯合還有放射增敏作用。


近來研究表明，異羥肟酸有組蛋白去乙酰化酶（histone deacetylase，HDAC）抑制劑活性，可抑制多種腫瘤細胞生長。異羥肟酸被廣泛稱為低毒性HDAC抑制劑。Tambunan US等研究提出了利用苯三唑對異羥肟酸修改，獲得一個更好的抑制劑。本研究觀察異羥肟酸對宮頸癌Hela和Siha細胞株生長和細胞周期的影響及p53mRNA和蛋白表達改變。


1.材料與方法


1.1材料


異羥肟酸購自Sigma公司，用PBS稀釋成500mmol/L，過濾分裝，貯藏于-20℃。P53抗體購自Santa Cruz公司，為鼠抗人單抗。RPMI-1640（Gibco公司）。TRIZOL試劑購自Invitrogen公司。新生牛血清（杭州四季青）。FACSort流式細胞儀為美國Becton Dickson公司產品。四甲基偶氮唑藍（MTT）、二甲基亞砜（DMSO）（Sigma）；AnnexinV-FITC凋亡和細胞周期分析試劑盒為Becton Dickinson公司產品。


1.2實驗方法


1.2.1細胞和細胞培養


Hela和Siha細胞株由本科室保存。細胞在5%CO2、37℃條件下，用含10%新生牛血清、青霉素（100U/ml）、鏈霉素（100U/ml）的RPMI-1640培養液培養傳代。


1.2.2 MTT實驗檢測生長抑制率


取對數生長期宮頸癌細胞，按細胞濃度為5×104/孔接種于96孔板。37℃、5%CO2飽和濕度培養24h后，分別加入不同濃度SAHA（0，1.2，2.4，5.0 mM）的培養基，每孔200μl，對照組不做處理。分別于加藥后0、1、2、3和4天，每孔加入MTT溶液（5mg/ml）20μl，37℃避光培養4h。徹底吸去MTT溶液，加入二甲基亞砜150μl/孔，震蕩10min，酶標儀490nm激發波長檢測吸光度。計算細胞的生長抑制率。細胞生長抑制率（%）=（1-實驗組吸光度值/對照組吸光度值）×100%。每次實驗設3復孔，實驗重復3次。


1.2.3流式細胞儀（FCM）檢測細胞凋亡和細胞周期


Hela細胞和Siha細胞分別用含（0，1.2，2.4，5.0 mM）SAHA的培養基培養48h。胰酶消化成單細胞懸液，1 000r/min離心5min收集細胞，加0.01mol/L PBS洗滌離心2次，用4℃75%乙醇固定過夜。1 000r/min離心5min，去掉乙醇固定液，PBS洗滌2次。加入PI染液1ml（50μg/mlPI、20μg/ml RNase、0.1%Triton-100），4℃孵育30min，FCM檢測凋亡細胞率。


1.2.4 RT-PCR檢測p53表達


分別收集用含（0，1.2，2.4，5.0 m M）SAHA處理48h的細胞。用TRIZOL提取細胞總mRNA，參照說明書進行。提取的mRNA用紫外分光光度計檢測RNA的純度和濃度（A260/A280>1.8）。取2μg mR-NA為模板，應用通用引物逆轉錄合成cDNA，以cDNA為模板進行PCR擴增。P53引物：正義鏈5′-cctcttcggcccagtggac-3′，反義鏈5′-ccgttttcgaccctgagag-3′，退火溫度60℃，共28個循環，擴增產物369bp；β-actin引物：正義鏈5′-ggcatcgtgatggactccg-3′，反義鏈5′-gctggaaggtggacagcga-3′，退火溫度62℃，共28個循環，擴增產物594bp。擴增條件為：94℃預變性3 min；94℃40 s，56℃40 s，72℃1min，30個循環；72℃延伸7 min。取PCR產物5μl在1.5%瓊脂糖凝膠上電泳（100 V，30 min）。凝膠成像系統成像，經薄層掃描求得每個待測產物與β-actin產物光密度之比，進行半定量分析。PCR產物在1.5%的瓊脂糖凝膠上電泳，電泳結果用英國UVP公司GDS8000型全自動圖像分析系統處理。


1.6 Western blot分析p53蛋白表達水平分別收集0，1.2，2.4，5.0 m M SAHA處理72 h的細胞，提取蛋白質，采用Bradford法定量蛋白質，取50μg蛋白進行SDS-PAGE凝膠電泳。然后電轉膜到硝酸纖維素膜上。室溫下搖動封閉4h。TBS-T洗滌3次，加一抗（p53按1∶100稀釋）在4℃下過夜。室溫下洗膜后加入辣根過氧化物酶偶聯兔抗小鼠IgG抗體，洗去未結合的二抗，滴加化學發光劑ECL進行發光顯影。TBS-T洗滌3次，再用二抗（1∶5 000稀釋的辣根過氧化物酶標記的羊抗鼠IgG）振蕩孵育2h。采用化學發光法（ECL）顯影。


1.3統計學處理


計量資料用均數±標準差（±s）表示，用SPSS11.5軟件進行統計，數據比較采用t檢驗，單變量多組資料之間比較采用單因素方差分析，以P<0.05為差異具有統計學意義。


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