2結果
2.1重組病毒的構建及鑒定
DEV感染DEF細胞2 h后，用Lipofectamine 2000轉染高純質粒pT-UL56-RFP。轉染后約10 h，即可見轉染細胞中有帶有紅色熒光的梭形細胞。72 h左右80%細胞出現病變，收獲病毒，凍融3次，用DEF細胞分離、純化紅色蝕斑，經過5代篩選，獲得純化的重組病毒DEVΔ3513-RFP。
按照同樣的方法，去除RFP獲得了缺失UL56基因下游3 513 bp的重組病毒DEVΔ3513；用UL56基因下游3 513 bp替換病毒DEVΔ3513-RFP中的RFP，獲得了回復突變株DEVΔ3513(R)。經測序鑒定，所構建的3個重組病毒均正確。
2.2一步生長曲線
一步生長曲線結果表明，重組病毒DEVΔ3513、DEVΔ3513(R)及其親本毒均在接種后72 h，病毒含量達到峰值（106.2-6.5TCID50/0.1mL），隨后病毒含量下降（圖5）。表明UL56下游3 513 bp的缺失對DEV的復制沒有明顯影響，缺失后病毒滴度無顯著變化。
圖2重組病毒的一步生長曲線
2.3蝕斑大小分析
重組病毒及其親本毒均能在DEF細胞中形成清晰蝕斑；親本毒、DEV-Δ3513、DEV-Δ3513(R)蝕斑面積分別為（1.91±0.28）mm2、（1.82±0.31）mm2、（1.98±0.25）mm2，無顯著差異（＞0.05）（圖5-9），說明UL56基因下游3 513 bp缺失不影響DEV在細胞間的傳播能力。
圖3重組毒及其親本毒蝕斑面積
2.4致病性試驗
DEV親本毒、重組病毒DEV-Δ3513(R)在接種后3日麻鴨開始出現精神沉郁狀；7日全部死亡，剖檢肝臟表面有大量散在的白色壞死點。病理組織學觀察可見：靜脈和肝血竇淤血，充滿大量紅細胞；肝細胞內有大量脂滴呈空泡狀，發生脂肪變性；部分區域出現局灶性肝細胞壞死，在壞死區域伴有炎性細胞，胞核溶解，與其他研究結果一致。而DEV-Δ3513接種鴨和對照鴨在14 d觀察期內，未出現任何臨床癥狀和死亡。病理組織學診斷可見肝臟組織結構清晰，肝細胞形態正常，未見明顯病理變化。說明UL56基因下游3 513 bp缺失后毒力明顯減弱。
2.5免疫原性測定
重組病毒DEVΔ3513以103.0TCID50/只、104.0TCID50/只劑量，免疫麻鴨后14 d，均能100%抵抗DEV強毒攻擊（表2），表明UL56基因下游3 513 bp缺失后仍具有良好免疫原性。
圖4肝臟病理切片（H.E.染色）
表2免疫后的攻毒保護效力
3討論
本研究以紅色熒光蛋白RFP為報告基因，以DEV參考強毒株為親本毒，通過同源重組，構建了缺失UL56基因下游3 513 bp的重組病毒DEVΔ3513及其回復突變株DEVΔ3513(R)。并對其細胞生長特性、致病性和免疫原性進行研究。體外試驗表明，重組病毒在細胞中的一步生長曲線、蝕斑大小與親本毒相似，說明UL56基因下游3 513 bp缺失不影響DEV在細胞上的生長，是病毒復制非必需基因。動物試驗結果表明，UL56基因下游3 513 bp缺失能顯著降低DEV的毒力，是DEV的一個毒力決定因子；缺失后仍保留良好的免疫原性，能抵抗致死性強毒攻擊，與現有商品化鴨瘟活疫苗免疫原性相當。
表3免疫后的攻毒保護效力
我國鴨瘟活疫苗毒株，其親本毒于1957年從我國廣東分離，然后經雞胚連續傳代60多代致弱。全基因組序列比較發現，與DEV參考強毒株相比，疫苗株基因組UL區5′端連續缺失了3 513 bp（2 716—6 228位核苷酸）導致UL56蛋白C端第215位氨基酸后移框變和UL55缺失。在α皰疹病毒中，除了牛皰疹病毒1型和5型外，均含有UL56同源物。UL56蛋白存在病毒粒子中。皰疹病毒UL56蛋白C端有一個疏水區，含跨膜區和多個PPxY基序等，為典型的跨膜錨定功能域。該功能域對維持單純皰疹病毒1型（herpes simplex virus 1，HSV-1）毒力表型具有重要作用。致病性HSV-1的UL56被LacZ替代后，腹膜內注射不能引起樹熊發病；弱毒HSV-1 HFEM株UL56基因被強毒HSV-1 17株的UL56替換后，能恢復其毒力表型，進一步研究表明，缺失UL56蛋白C末端疏水區（217—234位氨基酸）導致HSV-1毒力喪失。
本研究從DEV參考強毒與疫苗株基因組差異入手，分析了UL56基因下游3 513 bp對DEV參考強毒生物特性的影響，揭示了該區域對維持DEV毒力發揮了重要作用。下一步將縮小缺失范圍，重點研究UL56蛋白C末端疏水區對DEV毒力的影響。
4結論
4.1重組病毒生長特性與親本毒相似，首次證明UL56基因下游3 513 bp對DEV在細胞中的復制是非必需的。
4.2缺失UL56基因下游3 513 bp能顯著降低DEV的毒力，首次證明是UL56基因下游3 513 bp是DEV的一個毒力決定因子。
4.3缺失UL56基因下游3 513 bp后仍保留良好的免疫原性。
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